Mutacja wzmocnienia funkcji w genie HIF2A w rodzinnej erytrocytozie ad 5

Komórki traktowano lub traktowano pozornie 20 .g na mililitr cykloheksimidu przez okres do 45 minut, w celu zatrzymania syntezy białka. Komórki zebrano i następnie równe ilości lizatów badano za pomocą Western blot z przeciwciałami anty-Flag. Sygnały zostały określone ilościowo za pomocą systemu obrazowania ChemiDoc-It (UVP). Wyniki
Mutacyjna analiza
Heterozygotyczna zmiana G . T przy podstawie 1609 w eksonie 12 genu HIF2A została wykryta u pacjenta wskaźnikowego (Figura 1B). Ta zmiana przewiduje zastąpienie glicyny tryptofanem przy aminokwasie 537. Przebadaliśmy mutację G1609 . T, stosując analizę ARMS-PCR, w próbkach od matki i babki ze strony matki pacjenta z indeksem, u których stwierdzono erytrocytozę, oraz od nienaruszony ojciec i nienaruszone rodzeństwo. Wyniki wykazały, że mutacja ta jest segregowana z fenotypem erytrocytozy (ryc. 1C). Bezpośrednie sekwencjonowanie PCR potwierdziło obecność mutacji G1609 . T u członków rodziny dotkniętej chorobą (Figura 1B). Aby sprawdzić, czy ta mutacja jest polimorfizmem pojedynczego nukleotydu, panel kontrolny 200 próbek DNA przeszukiwano za pomocą ARMS-PCR; stwierdzono, że jest ujemna dla mutacji (dane nie przedstawione). Gly537, który jest konserwowany we wszystkich znanych białkach HIF-2., znajduje się w pobliżu Pro531 (głównego miejsca hydroksylacji w HIF-2.) i nie jest obecny w HIF-1., w HIF-3. lub w białku Hif z Drosophila melanogaster lub Caenorhabditis elegans (Figura 1D).
Testy wiązania i hydroksylazy
Rysunek 2. Rysunek 2. Charakterystyka funkcjonalna Gly537 . Trp czynnik indukujący hipoksję (HIF) 2. Mutant. Panel A pokazuje wyniki testów wiązania. Wejście reprezentuje 1% całkowitej ilości Gly537 . Trp GAL4-HIF-2. typu dzikiego (516-549) inkubowanego z (His) 6FagagPHD2. Panel B pokazuje wyniki oznaczeń hydroksylazy, w tym spektrometrii masowej z udziałem matrycy, desorpcji i jonizacji laserowej jonizacji czasu przelotu (MALDI-TOF). Pozycje niemodyfikowanych peptydów wynosiły 1877 amu dla dzikiego typu, a 2007 amu dla Gly537 . Trp, a dla hydroksylowanych peptydów 1893 jednostek masy atomowej dla typu dzikiego i 2023 amu dla Gly537 . Trp (jako addukty potasu). Małe piki w 1893 i 2023 w nietraktowanych próbkach (gwiazdki) prawdopodobnie reprezentują utlenianie metioniny w peptydzie. Panel C pokazuje wyniki eksperymentów badających zdolność peptydu typu dzikiego lub Gly537 . Trp HIF-2. (527-542) do konkurowania z hydroksylowanym GST-HIF-1. (531-575) pod kątem wiązania VHL. Wejście reprezentuje 25% całkowitej ilości VHL dodanej w tych eksperymentach. Panele D i F pokazują wyniki Western blotting. Panel D pokazuje poziomy białka stałego w stanie stacjonarnym i zmutowanego HIF-2., podczas gdy panel F pokazuje poziomy białka po zahamowaniu syntezy białek za pomocą cykloheksymidu. Panel E pokazuje wyniki testów PCR w czasie rzeczywistym. Poziomy transkryptów matrycowo-RNA z genu adrenomedulliny (ADM), N-myc regulowanego genu regulowanego (NDRG1) i genu czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF) mierzono za pomocą PCR w czasie rzeczywistym. Pokazano środki z trzech oddzielnych eksperymentów. T bary oznaczają standardowe odchylenia. Wartości P służą do porównania z HIF-2. indukowanym doksycykliną poziomami HIF-2. typu dzikiego
[więcej w: eticod, siesta łomianki, salonik wróżb ]