Mutacja wzmocnienia funkcji w genie HIF2A w rodzinnej erytrocytozie ad 6

W panelu F dla każdego konstruktu względny powrót do normalizacji został znormalizowany do wartości przez 0 minut, a pierwszy pasek pokazuje wyniki dla rodzicielskiej linii komórkowej. Hyp oznacza hydroksyloproksylinę i białko 2 domeny hydroksylazy prolilowej PHD2. Testy funkcjonalne in vitro wykazały, że PHD2, białko hydroksylujące, wiąże się słabiej ze zmutowanym peptydem Gly537 . Trp HIF-2. (516-549) niż z peptydem typu dzikiego (Figura 2A). Średnie (. SD) względne odzyskiwanie GAL4-HIF-2. typu dzikiego (516-549) z trzech powtórzeń (wyrażone w arbitralnych jednostkach) wynosiło 100 . 12, podczas gdy Gly537 . Trp GAL4-HIF-2. (516- 549) wynosił 12 . 7 (P <0,001).
Inkubowaliśmy również PHD2 z peptydem dzikiego typu lub Gly537 . Trp HIF-2. (527-542) i oceniano hydroksylację za pomocą spektrometrii masowej MALDI-TOF. Znaleźliśmy mniej hydroksylacji zmutowanym HIF-2. (Figura 2B). Ponadto, doświadczenia kompetycyjne wykazały, że VHL słabo wiąże się z hydroksylową formą prolilową Gly537 . Trp HIF-2. (527-542) w porównaniu z jego odpowiednikiem typu dzikiego (Figura 2C). Średni stopień zahamowania stwierdzony dla Hyp-HIF-2. typu dzikiego (527-542) wynosił 92 . 1,5%, podczas gdy dla Gly537 . Trp Hyp-HIF-2. (527-542) wynosił . 31% (P = 0,008). Dane te są dowodem, że mutacja wpływa na hydroksylację HIF-2. przez PHD2, jak również późniejsze rozpoznawanie HIF-2. przez VHL.
Western Blotting i Real-Time PCR
Wytworzyliśmy izogeniczne, stabilnie transfekowane komórki HEK293, które można indukować w celu ekspresji znakowanego flagą HIF-2. typu dzikiego, Gly537 . Trp HIF-2. lub Pro531 . Ala HIF-2. (jako kontrola z niedoborem hydroksylacji). Real-time PCR obejmujący startery specyficzne dla sekwencji nukleotydowej kodującej znacznik epitopowy wykazywał podobne poziomy informacyjnego RNA w konstruktach dzikiego typu i Gly537 . Trp (dane nie pokazane). Analiza Western wykazała, że w warunkach normoksycznych poziomy zmutowanego Gly537 . Trp HIF-2. są wyższe niż poziomy białka typu dzikiego, chociaż nie tak wysokie, jak poziomy Pro531 . Ala HIF-2. (Figura 2D). Warunki niedotlenienia (1% tlenu), które zwiększają poziom HIF-2. w stanie stacjonarnym, zmniejszają się, ale nie eliminują różnicy poziomów białka między typem dzikim a Gly537 . Trp HIF-2. (dane nie przedstawione). W warunkach normotoksycznych, w porównaniu z ekspresją HIF-2. typu dzikiego, ekspresja Gly537 . Trp HIF-2. indukowała znacząco zwiększone poziomy transkryptu mRNA z genu ADM, genu NDRG1 i genu VEGF, wszystkie cele HIF2A 5 (Figura 2E). Podobne wyniki uzyskano dla transfekowanego genu reporterowego zawierającego trzy kopie ludzkiego wzmacniacza erytropoetyny powyżej miejsca rozpoczęcia transkrypcji (dane nie pokazane). Po potraktowaniu komórek HEK293 cykloheksymidem w celu zatrzymania syntezy białka, mutant Gly537 . Trp z HIF-2. był degradowany wolniej niż HIF-2. typu dzikiego, chociaż nie tak wolno jak mutant Pro531 . Ala (Figura 2F). Podsumowując, wyniki testów funkcjonalnych wskazują, że mutacja Gly537 . Trp powoduje wzrost funkcji w HIF-2..
Dyskusja
Nasze odkrycia dowodzą, że HIF-2. jest czynnikiem transkrypcyjnym regulującym poziomy erytropoetyny u ludzi; wyniki potwierdzają również wcześniejsze wyniki, które wskazywały na taką samą rolę Hif-2. u myszy postembrionicznych. [14-17] Nasze dane nie wykluczają roli HIF-1. w regulacji erytropoetyny w pewnych okolicznościach; istnieją dowody na to, że izoforma ta odgrywa rolę w wytwarzaniu erytropoetyny podczas embriogenezy oraz w siatkówce dorosłych.12,13
Poprzednie badania in vitro wykazały tolerancję na niespodziewanie szeroki zakres podstawień aminokwasów w pobliżu głównego miejsca hydroksylacji HIF-..22,24. Nasze badanie pokazuje, że w kontekście fizjologicznym zakres tolerowanych substytucji aminokwasów jest może być znacznie węższy niż oczekiwano, co stanowi uzasadnienie dla zachowania aminokwasów w pobliżu miejsca hydroksylacji HIF-.
[przypisy: indrol, ezo szczecin, baspol ]