Mutacja wzmocnienia funkcji w genie HIF2A w rodzinnej erytrocytozie czesc 4

Przy użyciu standardowych metod skonstruowaliśmy plazmidy zawierające mutację Gly537 . Trp lub Pro531 . Ala, jak również plazmid pcDNA3-GAL4-HIF-2. (516-549) z mutacją Gly537 . Trp lub bez niej. Peptydy zostały zsyntetyzowane przez GenScript. Białka (His) 6FlagPHD2 i GST-HIF-1. (531-575) wytworzono w sposób opisany powyżej.22 Białka poddane translacji in vitro wytworzono przy użyciu zestawów TNT (Promega). Stabilnie transfekowane linie komórkowe HEK293 Flp-In T-Rex (Invitrogen), w których wektor pcDNA5 / FRT / TO jest zintegrowany w jedno określone locus genomowe, wytworzono stosując rekombinazę Flp (Promega), zgodnie z instrukcjami producenta. Testy
Testy wiązania, testy hydroksylazy, PCR w czasie rzeczywistym i Western blot przeprowadzono tak, jak opisano uprzednio. Za istotne statystycznie uznano 272 23 wartości P mniejsze niż 0,05.
W skrócie, w przypadku testów wiązania, znakowane 35S, translowane in vitro typu dzikiego lub Gly537 . Trp GAL4-HIF-2. (516-549), przygotowane z użyciem ekstraktów z kiełków pszenicy, inkubowano z 2 .g lub bez ( Jego) 6FlagPHD2. (His) 6FlagPHD2 poddano immunoprecypitacji z przeciwciałami anty-Flag i przemyto, i oceniano stopień wiązania. W doświadczeniach z konkurencją, GST-HIF-1. (531-575), uprzednio zwią- zany z agarozą glutationową, poddano hydroksylacji przez rekombinant PHD2, i oceniano pojemność 0,75-nM peptydu hydroksylo- proliny (Hyp) -HIF-2. (527-542) typu dzikiego lub peptyd Gly537 . Trp Hyp-HIF-2. (527-542) do hamowania wiązania znakowanego 35S VHL z lizatem retykulocytów do hydroksylowanego GST-HIF-1. (531-575).
W przypadku testów hydroksylazy, peptyd HIF-2. (527-542) typu dzikiego i peptyd Gly537 . Trp HIF-2. (527-542) traktowano rekombinowanym (His) 6FagagPHD2 lub traktowano pozornie samym buforem reakcyjnym; peptydy poddano wspomaganej matrycą desorpcji-jonizacji laserowej spektrometrii masowej z czasem przelotu (MALDI-TOF), przeprowadzonej na 4700 Proteomics Analyzer (Applied Biosystems).
Do analizy metodą Western blot linie komórkowe HEK293 Flp-In T-Rex stabilnie eksprymujące indukowalne typu dzikiego, Gly537 . Trp lub Pro531 . Ala 3xFlagHIF-2., lub macierzysta linia komórkowa, traktowano 0,1 .g doksycykliny na mililitr dla lub bez nich 16 godzin. Komórki zebrano i równe ilości lizatu komórkowego badano za pomocą Western blotting z użyciem przeciwciał anty-Flag lub anty-.-tubulinowych. Linie komórkowe eksponowano na warunki niedotlenienia (1% tlenu, 5% dwutlenku węgla i 94% azotu) w stacji roboczej In Vivo 200 Hypoxia (Ruskinn Technologies). Do testów PCR w czasie rzeczywistym linie komórkowe HEK293 Flp-In T-Rex traktowano .g doksycykliny na mililitr przez 16 godzin. Całkowity RNA został następnie wyekstrahowany z komórek i poddany odwrotnej transkrypcji. Poziom informacyjny RNA (mRNA) adrenomedulliny (ADM), N-myc regulowanego w dół genu (NDRG1) i czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF) mierzono za pomocą reakcji PCR w czasie rzeczywistym na PCR w czasie rzeczywistym Model 7300 maszyna (ABI). Względne oznaczenie ilościowe przeprowadzono za pomocą metody CT, z .-aktyną jako kontrolą endogenną. Grunty SYBR Green zostały zaprojektowane przy użyciu oprogramowania Primer Express, wersja 3.0 (Applied Biosystems).
W osobnym eksperymencie linie komórkowe HEK293 Flp-In T-Rex traktowano 0,1 .g doksycykliny na mililitr przez 16 godzin w warunkach normalnych
[więcej w: aminotransferaza asparaginianowa, baspol, salonik wróżb ]